藻膽色素既可作為抗氧化劑應(yīng)用于食品、保健品領(lǐng)域，又可作為熒光探針應(yīng)用于疾病診斷和光學(xué)治療領(lǐng)域，另外藻膽素還能夠有效地減少肝損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖。藻膽素在細(xì)胞或者生命體內(nèi)還可以被還原為一種類似于膽紅素的物質(zhì)，能夠有效地抑制 NADPH氧化酶的活性，進(jìn)而可以減少或治療某些NADPH酶導(dǎo)致的疾病，因此藻膽色素具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)價(jià)值。

1、藻膽色素的檢測(cè)與定量方法

采用紫外分光光度計(jì)及熒光分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和定量。藻膽色素具有共軛雙鍵體系，極易發(fā)生 π→π*，n→π*電子躍遷，因此可以利用熒光技術(shù)手段對(duì)其中的藻藍(lán)膽素和藻紅膽素進(jìn)行檢測(cè)。此外，藻藍(lán)膽素和藻紅膽素在特定的溶液中具有特定的吸收峰，從而可以根據(jù)吸收峰的位置及吸光度對(duì)其定性、定量分析。

操作步驟如下：

① 藻藍(lán)膽素的粗提：取 100 mL 的菌液，8000 g，離心 10 min 收集菌體。所得的菌體用 40 mL 甲醇在 50℃條件下，水浴加熱 1~2 h，至菌體沉淀呈白色，8000 g，離心，10 min 取上清待用；                       

 ② 特征吸收峰的測(cè)定：①中所得的藻藍(lán)膽素的甲醇溶液加入適量的濃鹽酸（VCH3OH:VHCl=95:5），測(cè)其紫外可見(jiàn)光吸收曲線；

③ 樣品濃度的計(jì)算：c(mM)=A680/37.9×稀釋倍數(shù)；

④ ①中藻藍(lán)膽素的甲醇溶液，測(cè)其紫外可見(jiàn)光吸收曲線，并根據(jù)吸收曲線測(cè)定其熒光發(fā)射光譜。

2.實(shí)驗(yàn)用品

2.1．材料：菌種（E.coli，BL21）

2.2．器材和儀器：精準(zhǔn)天平、紫外分光光度計(jì)、熒光光譜儀、pH計(jì)、紫外檢測(cè)儀、高速離心機(jī)、低溫恒溫槽、振蕩培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)、高壓滅菌鍋

2.3．大腸桿菌培養(yǎng)基：

LB培養(yǎng)基（1L）：10g NaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母浸粉，加去離子水至1L。

TB培養(yǎng)基（1L）：將12g胰蛋白胨，24g酵母浸粉，4mL甘油溶于900mL去離子水中，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻至60℃左右，再加100mL滅菌的17mM KH2PO4和72mM K2HPO4的溶液（2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4）                              

2.4．抗生素儲(chǔ)備液

卡納霉素儲(chǔ)備液：用無(wú)菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，簡(jiǎn)稱Kan）溶液，分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)每毫升培養(yǎng)基加入3～5mL，終濃度為30～50mg/mL。

3、實(shí)驗(yàn)流程

3.1 活化菌種：取保藏的工程菌菌種10 μl接入裝有5 ml的LB液體培養(yǎng)基的試管（不同的藻膽蛋白生物合成需要不同的抗生素）中，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)8-12小時(shí)。

3.2 擴(kuò)大培養(yǎng)：將試管中活化的1 ml菌液接種到250 ml LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入對(duì)應(yīng)的抗生素，培養(yǎng)基于37℃搖床振蕩培養(yǎng)。

3.3 色素蛋白生物合成：工程菌培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.6，10℃水浴中放置1 hr，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，20℃低溫過(guò)夜誘導(dǎo)后離心收集細(xì)胞，二次蒸餾水洗兩次。

3.4 離心：把菌體從發(fā)酵液里離心出來(lái)。

第一次離心

（1）首先電子秤取50g菌液到離心管內(nèi)

（2）將離心管放入離心機(jī)中

第二次離心

讓菌泥集中到一塊兒，方便取上清液

3.5 光譜分析  吸收光譜用紫外可見(jiàn)光譜儀，紫外可見(jiàn)光譜掃描范圍300～800nm，掃描速度960nm/min，狹縫寬度1.0nm。熒光光譜用熒光光譜儀，熒光光譜掃描速度1200nm/min ,狹縫寬度5.0nm。

4、結(jié)果分析

藻藍(lán)膽素在酸性甲醇溶液中，于680 nm 處的吸收峰是藻藍(lán)膽素的特征吸收峰，藻紅膽素在酸性甲醇溶液中，于440nm處的吸收峰是藻紅膽素的特征吸收峰。